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本荧光探针适合于检测细胞内的一氧化氮水平，可以进行实时检测。如果收集细胞后再装载探针，通常至少可以检测100个样品。

DAF-FM DA是最新一代用于一氧化氮定量检测的荧光探针，比以前比较常用的一氧化氮荧光检测探针DAF-2 diacetate有多方面的改进。首先，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，最后和一氧化氮反应形成的荧光产物受pH值的影响小，在pH值大于5.5时不受pH值的影响。其次，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者产生的荧光更加稳定，不容易淬灭，这样更加便于检测。另外，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者对一氧化氮的检测灵敏度更高，相同条件下检测灵敏度可以提高接近2倍，最低检测浓度可以达到3nM。

DAF-FM DA可以穿过细胞膜(cell-permeable)，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以产生强烈荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。DAF-FM DA检测一氧化氮的机制可以参考上图。任何可以检测fluorescein的仪器，包括荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于该荧光探针的检测。右图为DAF-FM在不同浓度一氧化氮存在时的发射荧光扫描图谱。

• 制备工作液
  工作液必须新鲜配制，实验结束即可丢弃稀释过的多余探针，染料在水溶液中更容易氧化分解，请尽快用完。本试剂盒提供的探针，可以满足切片或悬浮细胞（设置加载孵育液体积每个反应不超过0.5mL的情况下）至少100次。
  
• 装载探针
  对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
  
  • 原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000比例，用合适的新鲜培养基（不含血清和酚红）稀释DAF-FM DA，使终浓度为5μM。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DAF-FM DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DAF-FM DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。
    
  • 收集细胞后装载探针：按照1:1000比例，用合适的新鲜培养基（不含血清和酚红）稀释DAF-FM DA，使终浓度为5μM。细胞收集后，用稀释好的DAF-FM DA重悬细胞，细胞浓度为10⁶～2×10⁷/mL，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。上述操作可以在离心管内进行。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。直接用适当的阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后再刺激细胞。
  
  
• 一般注意事项
  
  • 一般来说，只要能获得足够的荧光信号即可，尽量选择最小浓度的探针染料，尽量减少酯的水解副产物（甲醛和乙酸）的富集。
    
  • 加载条件的选择尽可能考虑原有细胞的自然生长条件。一些研究者给出的建议是：生理温度较之室温对于染料的加载效果更好。
    
  • 第一次使用时请分装成小包装后-20℃保存，以避免反复冻融。
  
  
• 检测
  对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察(用普通的荧光显微镜观察效果相对较差)，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
  参数设置
  使用495nm激发波长，515nm发射波长，实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。DAF-FM和一氧化氮反应产物的荧光光谱和fluorescein非常相似，可以用检测fluorescein的参数设置进行检测，用检测FITC的参数设置进行检测也可以。
  
• 其它说明
  上述推荐的DAF-FM DA的工作浓度为5μM，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～5000的比例稀释DAF-FM DA，使装载探针时DAF-FM DA的浓度为1～2.5μM。相反，如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可以把DAF-FM DA的工作浓度为调整为10μM，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。